一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。病猪以新生仔猪的急性死亡，4 周龄以上的仔猪出现呕吐、神经症状和妊娠母猪流产、产死胎及呼吸道症状为主要特征，可能引起人的轻微感染。伪狂犬病的首次发现追溯到1813 年的美国牛群中，随后蔓延分布至全世界。1947 年，我国首次报道PRV，目前该病已在国内广泛流行。本病尚无有效治疗的药物，只能靠接种疫苗预防，给养猪业带来了巨大的经济损失。2015 年3 月，四川崇州某规模化猪场出现疑似伪狂犬病症状病猪，剖检发现患病猪扁桃体、肝和脾均有散在的白色坏死点，肾脏有针尖大小出血点，且出现神经症状的病猪脑脊液增多。本研究拟采集发病猪脑组织，进行基于PRV gE 基因的PCR 检测，经PCR检测为阳性的病料接种PK-15 细胞开展病毒分离，并将分离所得病毒株再次进行PCR 检测，用蚀斑实验测定该病毒株的滴度，采用琼扩实验对该病毒进一步鉴定。最后，根据相应诊断结果提出综合防治措施。

1、材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 病料采集

无菌采集崇州某猪场疑似PRV 发病仔猪脑组织，经研钵研磨后，加PBS配制1 ﹕ 5 组织悬液，-20 ℃冻存。

1.1.2 实验试剂

1 000 单位双抗；猪肾传代细胞（PK-15）由实验室保存；新生犊牛血清、DMEM 细胞培养液购自Gibco 公司；营养液（含10% 犊牛血清）、维持液（含2% 犊牛血清）、无钙镁水；饱和酚、氯仿、异丙醇、25% 冰乙醇；PRV 阳性血清、PCR试剂盒等。

1.2 实验方法

1.2.1 总DNA 提取

取出冻存的组织悬液，-20 ℃和37 ℃，反复冻融3 次，12 000 r/min 离心5 min ；取400 μL 上清液于无菌EP管中，加入500μL 饱和酚，混匀，静置5 min，4 ℃，12 000 r/min 离心5 min ；取上清，加入酚、氯仿各200 μL，混匀， 静置5 min，4℃，12 000 r/min离心5 min ；取上清，加入酚、氯仿各200μL， 混匀， 静置5 min，4 ℃，12 000 r/min 离心5min ；取上清，加入400μL 氯仿， 混匀， 静置5 min，4 ℃，12 000 r/min 离心5min ； 取上清， 加入2 倍体积异丙醇， 轻摇约2 min，室温静置15 min，4 ℃，12000r/min 离心15 min ；弃上清液，加入1 mL 25% 冰乙醇洗涤沉淀及管壁，4 ℃，12 000 r/min 离心5 min ；弃上清液，室温干燥沉淀后加入35μLddH2O 溶解，-20 ℃保存备用。同时，提取正常细胞的DNA 做阴性对照。

1.2.2 病料PCR 检测

根据GenBank上发表的PRV gE 基因保守序列设计合成1 对引物，上游引物：5’-TGCTCGTGATGACCCACAAA-3’；下游引物：5’-TGTACACCGGCGAGAGCAT-3’，预期目的片段大小为378 bp。引物序列送至宝生物工程（大连）有限公司合成。

以提取的病毒DNA和正常细胞DNA 为模板， 按照下列PCR 体系（10μL 体系）进行扩增（见表1）。

反应程序：94℃ 预变性5 min ；94 ℃变性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，总共35 个循环；72 ℃总延伸7 min；4 ℃保存。PCR 产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察记录实验结果。

1.2.3 病毒分离

取出冻存的组织悬液，反复冻融3 次，离心取上清， 每1 mL 上清液加1 000 单位双抗，置4 ℃处理过夜。

观察培养的PK-15细胞生长状况，当贴壁铺满单层，弃去培养液，无钙镁水洗2 ～ 3次，每瓶接种600μL处理好的组织悬液，对照组加入等量培养液。37℃吸附作用1 h，在此期间每隔15 min 轻轻摇晃细胞瓶，使细胞和病毒液充分接触。每瓶加入4 mL 维持液，37 ℃恒温培养箱培养。当细胞病变达70% 以上时收毒，即-20 ℃和37 ℃反复冻融3 次，3 000r/min 离心15 min，取上清。将收取的病毒液继续接种PK-15单层细胞传代培养，先盲传3 代，直至产生稳定的细胞病变，收毒，-70℃冻存。

1.2.4 病毒PCR 检测

按1.2.1 步骤，用酚、氯仿法抽提第5 代、第7 代病毒液总DNA，进行猪伪狂犬病病毒的PCR 检测。同时，应用本实验室建立的猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）RT-PCR检测方法和猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）PCR 检测方法，对第7 代病毒液进行外源性病毒检测。

1.2.5 蚀斑实验

将六孔培养板中各孔已长满单层细胞的的营养液吸弃，并将第7 代病毒液连续进行10 倍稀释，选取10-2稀释度，接种于六孔板各孔，每孔0.2 mL，轻轻摇动使病毒液均匀分布于细胞表面；置37 ℃的恒温培养箱培养，吸附1 h 后，加入1% 甲基纤维素培养基，使其均匀覆盖于细胞表面；置37℃恒温培养箱中，培养2 ～ 7 d ；将覆盖的甲基纤维素吸出弃之，用5% 福尔马林-1% 结晶紫固定染色液固定和染色感染细胞，每孔加入1 mL ；20 min 后，用水冲洗，观察细胞生长状况，记录蚀斑个数。

1.2.6 琼扩实验

用PBS 配制1% 琼脂液，倒于平板内制成凝胶。取打孔器在琼脂凝胶上打梅花孔，孔径为2 mm，中央孔与周围孔间距约3 mm。将病毒液作2 倍倍比稀释，即1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。中央孔滴加PRV阳性血清，周围孔分别滴加稀释后的病毒液。试验设立对照组，中央孔滴加PRV 阳性血清，周围各孔均滴加等量的稀释液。保持一定湿度，37 ℃恒温培养箱扩散24 h，观察记录沉淀线情况。

2、实验结果

2.1 病料PCR 检测

用组织悬液抽提得到的DNA 为模板，进行PCR 引物扩增，设立PRV 阴性和阳性对照，产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测， 以DNA Marker DL 2 000为标准，病料模板PCR 扩增产物大小近似378 bp，扩增出的特异性片段与预期的大小一致（图1）。

2.2 病毒分离

经处理的PCR检测为阳性的送检病猪病料，接种PK-15 细胞，盲传3代未见明显细胞病变。传至第4 代，接毒后46 h 可见部分细胞变圆、变亮、脱落形成典型的空斑，对照组无细胞变圆、脱落；病毒传至第5 代以后，感染后38 h 均可见80%左右细胞产生病变，主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且细胞病变初可见典型的空斑，即在PK-15细胞上产生稳定细胞病变，对照组细胞贴壁良好，无明显细胞病变（图2）。

2.3 病毒PCR 检测

用第5、第7 代病毒液抽提得到的DNA 为模板，进行PCR 引物扩增，设立PRV 阴性和阳性对照，产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA MarkerDL2 000 为标准，病毒液模板PCR 扩增产物大小近似378 bp，扩增出的特异性片段与预期的大小一致，而外源性病毒：CSFV、PRRSV、JEV、PPV、PCV2 检测均为阴性（图3）。

2.4 蚀斑实验

将收获的第7 代病毒液稀释后，选择10-2 稀释度接种PK-15 细胞，接种后于37 ℃培养箱避光培养5 d，观察并记录蚀斑个数，测得六孔板中平均每孔形成53 个蚀斑，则病毒悬液的蚀斑形成单位为2.65 ×104 PFU/mL，即每1 mL病毒液滴度为2.65×104 PFU（图4）。

2.5 琼扩实验

将病毒液作2 倍倍比稀释，实验组中央孔滴加PRV 阳性血清，周围孔分别滴加稀释后的病毒液。对照组中央孔滴加PRV 阳性血清，周围孔滴加等量的病毒稀释液。结果发现：病毒原液至32 倍稀释均可见抗原抗体沉淀带，从64 倍稀释度开始未见沉淀带。对照组中均未见抗原抗体沉淀带（见图5）。

3、结果讨论

目前，我们已掌握许多对猪伪狂犬病病毒进行分离鉴定的方法，比如聚合酶链式反应（polymerase chainreaction，PCR）、蚀斑实验（plaqueformation test）、琼脂凝胶免疫扩散实验（agar gelimmunodiffusion test，AGID）等。PCR技术又称为体外基因扩增技术， 诞生于1985 年。Belak 等应用gB 基因引物率先建立了检测PRV的PCR方法，检测PRV 与其他猪病毒病的多重PCR 方法在近年也相继建立。PCR 具有敏感、快速、特异性强等优点，还能活体检测大批量样品，目前在病毒鉴定上已经得到广泛运用 ；AGID 最早的应用是在1905 年为研究利泽甘氏现象，1932 年应用于细菌菌株的鉴定。Oudin 于1946 年在试管中进行了琼扩实验，对抗原混合物进行分析。Elek和 Ouchterlony 于1948 年分别建立了琼脂双向双扩散法，可以同时鉴定、比较2 种以上抗原或抗体，并对免疫扩散的理论依据相继进行了研究。琼扩试验操作简单、快捷，较适用于现场定性诊断和猪群阴性无感染者的普查，但结果易受pH、温度等影响。

PRV 广泛分布于机体各组织脏器中，比如扁桃体、肝脏、脾脏、肺和肾脏，但感染量以脑部三叉神经节居多，因此实验中主要采集病猪脑组织进行病毒的分离培养。PRV 具有泛嗜性，能在许多细胞中增殖，其中以ST细胞和PK-15 细胞最敏感，在接种后24 ～72 h 可出现典型的细胞病变，其次是BHK-21、MDBK、CEF 等细胞。试验中常用PK-15、BHK-21、MDBK 等传代细胞系分离培养该病毒。

本实验从病猪脑组织分离得到1 株PRV，对该株病毒进行PCR 检测、蚀斑实验、琼扩实验后，证实该分离是成功的。针对以上实验结果，对猪场建议主要包括以下几个方面。第一，立即淘汰出现相应临床特征的猪群，尤其是仔猪和种猪，同时采用2% ～ 3% 氢氧化钠或熟石灰对相应圈舍地面、墙壁及周围场地进行严格消毒处理。第二，抽取猪场中所有猪只血样，并标记清楚。用PRV gE 抗体检测试剂盒进行抗体检测，淘汰检测结果呈阳性的全部猪只，阴性猪只进行严格隔离饲养。对测定结果为可疑的猪只先实行隔离饲养，然后重新采血检测，根据检测结果作出相应处理。第三，采集隔离饲养的所有健康猪群血样，进行PRV gB 抗体检测，对所有阴性猪只紧急接种弱毒疫苗。第四，完善饲养管理制度。严禁从PRV阳性猪场引种，对待引进猪只采血检测，确定为阴性后方可引进，最好自繁自养。猪群尽量做到全进全出。猪场实行封闭式管理，外来人员必须经过相应消毒措施处理，隔离3 d 后才可进入生产区。圈舍和周围场地平时严格消毒，做好清洁卫生。针对不同生长阶段的猪群，合理搭配日粮。第五，制定合理免疫程序。仔猪出生3 日龄后进行伪狂犬病疫苗滴鼻免疫，5 ～ 6 周龄时肌肉注射1 头份，种公猪每半年普免1 次，母猪产前3 个月普免1 次。（资料来源：杨凡等,猪业科学）